การศึกษาการหาสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการนำพลาสมิด pDsRed-AT1R เข้าสู่เซลล์ HEK-293 โดยใช้ FuGENE6 |
| โดย: นางสาวเพียงขวัญ ใจแก้ว,นางสาวรัชนก ฉัตรปราการ ปีการศึกษา: 2555 กลุ่มที่: 30 อาจารย์ที่ปรึกษา: ศุภโชค มั่งมูล ภาควิชา: ภาควิชาเภสัชวิทยา Keyword: พลาสมิด pDsRed-AT1R, เซลล์ HEK-293, สภาวะที่เหมาะสมในการนำพลาสมิดเข้าสู่เซลล์, pDsRed-AT1R plasmid, HEK-293 cell, optimal condition for transfection, FuGENE 6 |
| บทคัดย่อ: การนำพลาสมิดpDsRed-AT1R เข้าสู่เซลล์HEK-293เป็นกระบวนการที่เรียกว่า Transfection ซึ่งมีความสำคัญในการศึกษาการทำงานของยีนและการแสดงออกของโปรตีน เพื่อให้เกิดประสิทธิภาพสูงสุดในการนำพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ซึ่งต้องคำนึงถึงปัจจัยที่มีผลเหล่านี้ได้แก่ จำนวนเซลล์ ปริมาณพลาสมิด ชนิดของ transfection reagent เป็นต้น ในการทดสอบหาสภาวะที่เหมาะสมในการนำเอา pDsRed-AT1R เข้าสู่เซลล์ HEK-293 โดยที่เราจะนับจำนวนเซลล์ที่มีpDsRed-AT1R อยู่บนผิวเซลล์ โดยการใช้กล้อง fluorescent microscope ส่องดูเซลล์ที่ติดสีแดง การทดลองในขั้นแรกได้กำหนดปริมาณของ FuGENE 6 transfection reagent 2 ?l และปริมาณ pDsRed-AT1R plasmids 1 ?g ให้คงที่ พบว่ามีจำนวน DsRed-AT1R expressing cells มากที่สุดในตัวอย่างที่มีจำนวนเซลล์ HEK-293 ที่ 0.5x105 cells/dish ซึ่งมีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 293.67 เซลล์ หลังจากนั้นทำการหาปริมาณ FuGENE 6 transfection reagent และ ปริมาณ pDsRed-AT1Rplasmids ที่เหมาะสมโดยกำหนดให้จำนวนเซลล์ HEK-293คงที่ที่ 0.5x105 cells/dish ผลการวิจัยพบว่ามีจำนวน DsRed-AT1R expressing cells มากที่สุดในตัวอย่าง FuGENE 6 2 ?l, pDsRed-AT1R 1 ?gเฉลี่ยเท่ากับ 333.50cells ภายหลังจากนำพลาสมิดเข้าภายในเซลล์พบว่า DsRed-AT1R จะอยู่บนผิวเซลล์ เมื่อถูกกระตุ้นด้วย Angiotensin II ซึ่งเป็น agonist จะเกิดการเคลื่อนที่ของรีเซปเตอร์จากผิวเซลล์เข้าสู่ภายในเซลล์ เรียกกระบวนการนี้ว่า internalization การศึกษานี้สรุปได้ว่าสภาวะที่เหมาะสมคือจำนวนเซลล์ HEK-293 เท่ากับ 0.5x105 cells/dish ปริมาณ FuGENE 6 เท่ากับ 2 ?l และปริมาณ pDsRed- AT1R เท่ากับ 1 ?gการทดลองนี้เป็นจุดเริ่มต้นในการวิจัยและค้นคว้าหาสาระสำคัญที่มีผลต่อการทำงานของ AT1R |
| abstract: Transfection is the process which introducing various macromolecules into an eukaryotic cell. The highest transfection efficiency requires considered optimal conditions such as number of cells, amounts of plasmid and volume of transfecting reagent. In this experiment, we used pDsRed-AT1R plasmid, human embryonic kidney 293 (HEK-293) cells, and FuGENE6 transfection reagent to determine the optimal conditions for bringing DsRed-AT1R into and expressing in HEK-293 cells. The DsRed-AT1R expressing cells (red color) were detected and counted via fluorescent microscope. The volume of FuGENE6 and the amount of pDsRed-AT1R plasmid were fixed as 2 ?l and 1 ?g, respectively in the initial step. We found that the maximum amount of DsRed-AT1R expressing cells (293.67 cells) shown in 0.5x105 HEK-293 cells per 35-mm dish. By using the 0.5x105 cells/dish, the highest number of DsRed-AT1R expressing cells (333.50 cells) is found when using 2 ?l of FuGENE 6 and 1 ?g of pDsRed-AT1R plasmid. When Angiotensin II binding to DsRed-AT1R, the receptors that expressed on plasma membrane were internalized into the cytosol. This process called receptor internalization. In conclusion, the optimal conditions which are number of cells, volume of FuGENE6 , amount of pDsRed- AT1R for transfecting are 0.5x105 cells/dish, 2 ?l and 1 ?g, respectively. This study provides a data which may be used in researching AT1R functions as well as the efforts to analyze the AT1R affecting substances. |
| . |