การศึกษาการหาสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการนำพลาสมิด pEGFP-β1AR เข้าสู่เซลล์ HEK-293 โดยใช้ FuGENE 6 |
| โดย: อภิสิทธิ์ พาบุญ, ปิยาภรณ์ ดวงจินดา ปีการศึกษา: 2554 กลุ่มที่: 19 อาจารย์ที่ปรึกษา: ศุภโชค มั่งมูล ภาควิชา: ภาควิชาเภสัชวิทยา Keyword: พลาสมิด pEGFP-β1AR, เซลล์ HEK-293, FuGENE6, ประสิทธิภาพในการนำพลาสมิดเข้าสู่เซลล์, pEGFP-β1AR plasmid, HEK-293 cells, FuGENE6, transfection efficiency |
| บทคัดย่อ: การนำเอาพลาสมิด (plasmid) เข้าสู่เซลล์โดยใช้ transfection reagents จำเป็นต้องหาสภาวะที่เหมาะสม (optimal condition) ได้แก่ ปริมาณพลาสมิด, จำนวนเซลล์และปริมาณ transfection reagents เพื่อให้ได้ประสิทธิภาพสูงสุดในการนำพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ (maximum transfection efficiency) การทดลองครั้งนี้ เราใช้พลาสมิด pEGFP-β1AR ซึ่งเป็นพลาสมิดที่มียีนของ β1-adrenergic receptor (β1AR) ที่เชื่อมต่อด้วย GFP (green fluorescent protein), เซลล์ HEK-293 และ FuGENE6 transfection reagent ในการทดสอบหาสภาวะที่เหมาะสมในการนำ GFP-β1AR เข้าสู่เซลล์ HEK-293 โดยนับจำนวนเซลล์ที่มี GFP-β1AR อยู่บนผิวเซลล์ โดยการใช้กล้อง fluorescent microscope ส่องดูเซลล์ที่ติดสีเขียว (green fluorescent color) จากการทดลองพบว่าปริมาณที่เหมาะสมของเซลล์ HEK-293 คือ 1×105 cells/35mm glass bottom dish และอัตราส่วนที่เหมาะสมของปริมาณพลาสมิด pEGFP-β1AR ต่อ FuGENE6 คือ พลาสมิด 1 µg ต่อ FuGENE6 1 µl นอกจากนี้เรายังศึกษาการทำงานของ GFP-β1AR ว่ามีการทำงานที่ปกติหรือไม่โดยการกระตุ้น GFP-β1AR ด้วย isoproterenol (βAR agonist) หลังจากกระตุ้นรีเซปเตอร์ด้วย isoproterenol พบว่า GFP-β1AR ที่อยู่บนผิวเซลล์จะ internalize เข้าสู่ cytosol เราเรียกขบวนการนี้ว่า “receptor internalization” ซึ่งในการทดสอบครั้งนี้พบว่า GFP-β1AR ที่ถูกนำเข้าสู่เซลล์ยังสามารถทำงานได้เป็นปกติที่สภาวะเหมาะดังกล่าวข้างต้น |
| abstract: The bringing of plasmid (containing foreign DNA) into the cells by using any transfection reagents must be required to find the optimal conditions such as amount of plasmid, number of cells, and volume of transfection reagent for obtaining the maximum transfection efficiency. In this experiment, we used pEGFP-β1AR plasmid, human embryonic kidney 293 (HEK-293) cells, and FuGENE6 transfection reagent to find the optimal conditions for bringing GFP-β1AR into and expressing in HEK-293 cells. We count the cells that express GFP-β1AR as shown in green color when monitorcells with fluorescent microscope. We found that the proper amount of cells is 1x105 cells per 35 mm glass bottom dish and the optimal proportion between pEGFP-β1AR and FuGENE6 is plasmid 1 µg per FuGENE6 1 µl that provided the highest transfection efficiency. In addition, we also monitor the functional property of GFP-β1AR by stimulation this receptor with isoproterenol (βAR agonist). After stimulation with isoproterenol, the GFP-β1ARs that expressed on plasma membrane are internalized into the cytosol. This process called receptor internalization. We found that GFP-β1ARs which transfected into HEK-293 cells at optimal conditions are function normally. |
| . |