การนำดีเอ็นเอเข้าสู่แลคโตบาซิลลัสอย่างรวดเร็วโดย Electroporation |
| โดย: ทรงกฤษณ์ โสภาจารีย์ ปีการศึกษา: 2539 กลุ่มที่: 1 อาจารย์ที่ปรึกษา: จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์ , อารมณ์ พงษ์พันธุ์ ภาควิชา: ภาควิชาจุลชีววิทยา Keyword: , |
| บทคัดย่อ: โครงการพิเศษนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการนำพลาสมิด pHY300-PLK ซึ่งเป็น Shuttle Vector เข้าสู่เซลล์แลตโตบาซิลลัส พลาสมิด pHY300-PLK มีคุณสมบัติดื้อยาปฎิฃีวนะแอมพิซิลลิน และเตตร้าซัยคลิน เมื่อเพิ่มจำนวนใน Escherichis coli จะแสดงคุณสมบัติดื้อยาเตตร้าซัยคลิน เมื่อยู่ในแบคทีเรียแกรมบวก ดังนั้น จึงได้คัดเลือกเชื้อแลคโตบาซิลไล จาก Stock cultures ที่มีอยู่แล้วจำนวน 5 ฃนิด แยกเชื้อโดยการทดสอบความไวต่อยาปฎิชีวนะต่างๆ เช่น นีโอมัยซิน, คลอกซ่าซิลลิน, กานามัยซัน, เตตร้าซัยคลิน, คลอแรมแฟนนิคอล, อิริโทรมัยซิน โดยวิธี disc diffusion method พบว่าเชื้อ Lactobacillus casei subsp., pseudoplantarum และ L. acidophilus ไม่ดื้อต่อยาปฎิชีวนะเตตร้าซัยคลิน ส่วนเชื้อทั้งสองดื้อต่อยาอื่น จึงใช้เชื้อทั้งสองไปเตรียมเป็นเซลล์เจ้าบ้านดังต่อไปนี้ โดยหาเวลาที่เชื้อเพิ่มจำนวนจนได้ 109 เซลล์/มล. แล้วนำไปปั่นเพื่อ pack cells แล้วทำให้เป็น suspension โดย phosphate buffer จึงนำไปทดลอง transformation โดยวิธีอิเลคโตรพอเรชั่น โดยใช้สภาวะต่างๆ กัน พบว่าสภาวะที่เหมาะสม คือค่าความต่างศักย์ 2.5 KV กระแส 25 uF ค่าความต้านทาน 800 โอห์ม เวลา 8.48 msec จากนั้นนำ transformants ที่เจริญได้บนอาหารเลี้ยงเชื้อ MRS ผสมกับยาเตตร้าซัยคลินมาสกัดแยกพลาสมิด เพื่อพิสูจน์ว่าการที่เชื้อดื้อยานั้นเนื่องจากได้รับพลาสมิด pHY300-PLK |
| abstract: The objective of this special project is to study the experimental conditions for transfering plasmid into Lactobacillus spp. by electroporation. Plasmid pHY300-PLK confering tetracycline resistance in gram positive bacteria was selected for this study. Thus, tetracycline sensitive lactobacilli were selected from our culture collection by antibiotic disk diffusion method. There were found that Lactobacillus casei var. pseudoplantarum and L. acidophillus were sensitive to tetracycline, therefore, they were used as hosts. Subsequently, suitable growth conditions of the selected Lactobacillus were studied, and various conditions of electroporation were carried out. It was found that the suitable conditions for introducing plasmid pHY300-PLK into L. casei var. pseudoplantarum and L. acidophillus were 2.5 kV, capacitor 25 uF, resistance 800 Ohm, at 8.48 msec. |
| . |