การตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ตับโดยการใช้พาราเซตามอลเป็นสารทดสอบ

โดย: นางสาวพรรษรัตน์ เบญจมกุล, นางสาวพลอยไพลิน พงษ์ปภาดา ปีการศึกษา: 2559 กลุ่มที่: 6

อาจารย์ที่ปรึกษา: คณิสส์ เสงี่ยมสุนทร , มนตรี ยะสาวงษ์ ภาควิชา: ภาควิชาชีวเคมี

Keyword: paracetamol induced hepatotoxicity, HepaRG, Hepatocyte-Like cell, NAPQI, NAC, Paracetamol induced hepatotoxicity, HepaRG, Hepatocyte-Like cell, NAPQI, NAC

บทคัดย่อ:
แบบจาลองในการตรวจสอบสารเมตาบอไลท์ที่เป็นพิษต่อเซลล์ตับที่เปลี่ยนแปลงมาจากสารเคมีหรือยามีข้อจากัด เนื่องจากเซลล์ตับที่ใช้ทดสอบขาดการทางานของเอนไซม์ phase I และ phase II จึงไม่พบพิษในเซลล์ตับเพาะเลี้ยงดั้งเดิม เพื่อพัฒนาวิธีการตรวจสอบผลของเมตาบอไลท์ที่เป็นพิษ จึงนาพาราเซตามอลและ N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) มาบ่มกับเซลล์คล้ายเซลล์ตับ (hepatocyte-like cell: HLC) และเซลล์มะเร็งตับ HepaRG เพื่อตรวจวัดช่วงความเข้มข้นของสารที่มีเป็นพิษต่อเซลล์และวัดการแสดงออกของยีนของเอนไซม์ใน phase I เช่น CYP1A2 CYP3A4 และ CYP2E1 และ phase II เช่น ยีนต้านอนุมูลอิสระ catalase Nrf2 GCLC GCLM และ GPX ด้วยวิธี real-time PCR นอกจากนั้นยังศึกษาผลของ N-Acetylcysteine (NAC) ในการยับยั้งความเป็นพิษของพาราเซตามอล ผลการทดลองพบว่าค่า IC50 ของ พาราเซตามอลในเซลล์ HLC และ HepaRG เท่ากับ 15 และ 7.5 mM ตามลาดับ ส่วน N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) ไม่พบความเป็นพิษในทั้งสองเซลล์ เมื่อบ่มเซลล์ร่วมกับเอทานอลก่อนได้รับพาราเซตามอลไม่พบการเปลี่ยนแปลงค่าความเป็นพิษชัดเจน ส่วนการแดงออกของยีน catalase ในเซลล์ HLC เพิ่มขึ้น 2.5 เท่า GCLC 2.1 เท่า GCLM 2 เท่า และ Nrf2 1.5 เท่า ส่วนในเซลล์ HepaRG ไม่มีการเปลี่ยนแปลงและการได้รับ N-acetylcysteine (NAC) ไม่ส่งผลต่อการแสดงออกของยีนต้านอนุมูลอิสระของเซลล์ทั้งสองชนิด นอกจากนั้นพบว่าพาราเซตามอลเพิ่มการแสดงออกของ CYP1A2, CYP3A4 และ CYP2E1 1-100 เท่าใน HLC แต่ไม่มีความสัมพันธ์ใน HepaRG เมื่อบ่มเซลล์ HLC กับพาราเซตามอลและ N-Acetylcysteine (NAC) พบกลุ่มยีนต้านอนุมูลอิสระเพิ่มขึ้นหลังจาก 8 ชั่วโมง ผลการทดลองสรุปว่าเซลล์ทั้งสองชนิดมีการตอบสนองต่อพาราเซตามอลและ N-acetylcysteine (NAC) ที่แตกต่างกันทั้งด้านความเป็นพิษและการเพิ่มการทางานของใน phase I และ phase II เซลล์ทั้งสองชนิดสามารถเป็นตัวแทนในการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ตับได้ หากศึกษาสภาวะที่เหมาะสมก่อนการทดสอบ

abstract:
The models for the detection of the hepatotoxic metabolite quite have the limitation. Due to the lack of liver enzymes in phase I and phase II in classical hepatocyte cell lines, the toxicity could not be seen. To develop hepatotoxic metabolite, paracetamol and N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) were used as the testing compounds. Hepatocyte-like cell (Hepatocyte-Like cell: HLC) and HepaRG were incubated with paracetamol or NAPQI for detecting the toxic concentration using fluorescence microplate reader. Herein, the gene expression in phase I (e.g. CYP1A2, CYP3A4 and CYP2E1) and phase II enzymes (e.g. catalase, Nrf2, GCLC, GCLM and GPX) detected by real-time PCR. Moreover, we also investigate the ability of N-acetylcysteine (NAC) in term of decreasing paracetamol toxicity. The results revealed that IC50 of paracetamol in HLC and HepaRG cell line were 15 and 7.5 mM respectively. NAPQI did not show the toxicity in both cells clearly. Incubated with ethanol prior to treat with paracetamol did not alter the toxic concentration in both cells whereas the level of catalase, GCLC, GCLM and Nrf2 increased to 2.5, 2.1, 2 and 1.5 folds respectively only in HLC. The result showed that NAC have no effect in antioxidant gene expression in both cells. Moreover, treated cells with paracetamol increased the expression of CYP1A2, CYP3A4 and CYP2E1 about 1-100 folds in HLC though HepaRG cell lines did not have a correlation. The antioxidant enzymes have elevated from the baseline after incubated HLC with paracetamol and N-acetylcysteine (NAC) for more than 8 hours. In conclusion, HLC and HepaRG have the distinguish response to paracetamol and NAC in toxicity, phase I and phase II activity. Both cells can be applied as a novel model for hepatotoxicity test in proper condition.