การพัฒนาวิธีการทดสอบยีน invA ของเชื้อ Salmonella spp. |
| โดย: ณัฏฐพิชา เฮงพระพรหม, พรพรรณ นิติภานนท์ ปีการศึกษา: 2552 กลุ่มที่: 6 อาจารย์ที่ปรึกษา: จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์ ภาควิชา: ภาควิชาจุลชีววิทยา Keyword: Salmonella spp., Loop-mediated isothermal amplification, LAMP, Salmonella spp., Loop-mediated isothermal amplification, LAMP |
| บทคัดย่อ: Salmonella spp. เป็นแบคทีเรียก่อโรคทางเดินอาหารที่สำคัญ เป็นสาเหตุของโรคเช่น โรคลำไส้อักเสบ ไทฟอยด์ หรือการติดเชื้อในกระแสเลือด มักพบปนเปื้อนในอาหารประเภทเนื้อสัตว์ ไก่ นม ไข่ และผัก วัตถุประสงค์ในการศึกษานี้เพื่อพัฒนาวิธีการตรวจสอบอย่างรวดเร็ว โดยการตรวจสอบยีน invA ขนาด 210 bp ของเชื้อ Salmonella spp. โดยใช้เทคนิค Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) LAMP เป็นเทคนิคใหม่ที่สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเออย่างมีประสิทธิภาพ มีความจำเพาะสูง และสามารถทำได้อย่างรวดเร็วภายใต้อุณหภูมิคงที่ ในการทดลองนี้ได้ทำการออกแบบ primers ที่มีความจำเพาะต่อยีน invA ของ Salmonella enterica จำนวน 4 เส้น โดยใช้โปรแกรม PrimerExplorer V4 (http://primerexplorer.jp/e/) แล้วนำ primers ที่ได้ไปทดสอบความจำเพาะต่อยีน invA จาก genomic DNA ของ Salmonella spp. โดยเทคนิค LAMP ที่อุณหภูมิ 65°ซ. ภายในเวลา 50 นาที พบว่าให้ผลบวกกับเชื้อ S. Typhi, S. Typhimurium, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B, และ S. Mbandaka ส่วนการตรวจสอบ genomic DNA ของแบคทีเรียกลุ่ม Non-Salmonella ได้แก่ Bacillus sphaericus, Escherichia coli, และ Staphylococcus aureus พบว่าให้ผลลบ การทดสอบความไว (sensitivity) ของการตรวจสอบเชื้อ Salmonella Typhi พบว่าความเข้มข้นของดีเอ็นเอน้อยที่สุดที่สามารถตรวจพบได้โดยเทคนิค LAMP คือ 5.6 pgDNA/l ซึ่งมี ความไวมากกว่าการตรวจสอบโดยเทคนิค Polymerase Chain Reaction (PCR) ที่ต้องมีความเข้มข้นของดีเอ็นเอน้อยที่สุดที่สามารถตรวจพบได้คือ 320 pgDNA/l นอกจากนี้เทคนิค LAMP ยังใช้เวลาในการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอเพียง 50 นาที ในขณะที่เทคนิค PCR ใช้เวลาทั้งหมด 90 นาที อีกทั้งเทคนิค LAMP ยังไม่จำเป็นต้องใช้ agarose gel electrophoresis เพื่อการพิสูจน์ดีเอ็นเอ เพราะเทคนิค LAMP สามารถตรวจสอบดีเอ็นเอโดยสังเกตความขุ่น หรือการเติมสี SYBR green I ดังนั้นเทคนิค LAMP จึงเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพ รวดเร็ว มีความจำเพาะเจาะจงในการตรวจสอบยีน invA ของเชื้อ Salmonella spp. |
| abstract: Salmonella spp. is a major food-borne pathogen found in meat, chicken, milk, egg and vegetable. Salmonella infections could be gastroenteritis, typhoid fever or bacteremia. The aim of this study is to develop a rapid test for detection the Salmonella-specific 210bp invA gene by using Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique. LAMP assay is a novel technique that amplifies DNA with high specificity, efficiency and rapidity under isothermal conditions. In this study, two pairs of primers were designed based on invA gene of Salmonella enterica using PrimerExplorer V4 software program (http://primerexplorer.jp/e/). The primers were used to amplify the invA gene from genomic DNA of Salmonella spp. at 65 oC for 50 min by LAMP technique. The positive results were found when using genomic DNAs of S. Typhi, S. Typhimurium, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B, and S. Mbandaka as templates. But also the negative results were found when using genomic DNAs of Bacillus sphaericus, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus as templates. Comparison in sensitivity and detection limits for detection of S. Typhi showed that the detection limit of the LAMP assay was 5.6 pgDNA/l, while the Polymerase Chain Reaction (PCR) assay was 320 pgDNA/l. In addition, the final results were obtained within 50 minutes for the LAMP assay, whereas the PCR needed approximately 90 minutes. Furthermore, there was no need to run agarose gel electrophoresis to demonstrate the amplified products. LAMP product could be visualized by turbidity or adding SYBR green I. Thus, LAMP was more sensitive, rapid and simple to perform than PCR to detect the specific invA gene of Salmonella spp. |
| . |