การพัฒนาการตรวจเชื้อ Escherichia coli อย่างรวดเร็ว โดยเทคนิค LAMP |
| โดย: นางสาวลักขณา จงวัฒนาไพศาล, นายวรรณปสิจธ์ ลืออุดมธนสาร ปีการศึกษา: 2557 กลุ่มที่: 1 อาจารย์ที่ปรึกษา: จตุรงค์ ประเทืองเดชกุล , จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์ ภาควิชา: ภาควิชาจุลชีววิทยา Keyword: Escherichia coli O157:H7, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), polymerase chain reaction (PCR), Escherichia coli O157:H7, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), polymerase chain reaction (PCR) |
| บทคัดย่อ: Escherichia coli O157:H7 เป็นแบคทีเรียก่อโรคที่รุนแรง ทาให้เกิดอาการท้องร่วง ลาไส้ใหญ่อักเสบ และอาจนาไปสู่อาการไตวายเฉียบพลันได้ สาเหตุในการติดเชื้อนี้คือ การสัมผัสสัตว์ที่เป็นพาหะ มูลสัตว์ หรือการบริโภคเนื้อที่ปรุงไม่สุก การศึกษานี้จึงพัฒนาขึ้นเพื่อให้เกิดประโยชน์ในการตรวจสอบเชื้อจากการเก็บตัวอย่างได้สะดวกและรวดเร็วยิ่งขึ้น โดยใช้เทคนิค Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) ที่ออกแบบ Primer ด้วยโปรแกรม PrimerExplorer V4 และมียีน shiga toxin เป็นยีนเป้าหมาย จากผลการทดลองพบว่า ผลการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค PCR มีความจาเพาะสูง แต่ผลการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค LAMP มีความจาเพาะต่า เมื่อนาผลิตภัณฑ์ จากเทคนิค LAMP และผลิตภัณฑ์ดังกล่าวที่ถูกตัดด้วยเอนไซม์ Alu I มาวิเคราะห์ด้วยวิธี electrophoresis บน 2% และ 3% agarose gel ตามลาดับ ย้อมด้วย ethidium bromide แล้วนาไปส่องเพื่อดูแถบสีดีเอ็นเอภายใต้ UV light พบว่า แถบแสดงขนาดนิวคลีโอไทด์ที่ปรากฏ มักไม่เป็นไปตามที่คานวณไว้ และเกิด negative error บ่อยครั้ง จึงได้ทาการวิเคราะห์รูปแบบการเกิดโครงสร้างของผลิตภัณฑ์ที่ผิดปกติ โดยศึกษาการเข้าจับกันในรูปแบบอื่นที่เป็นไปได้ด้วยโปรแกรมOligoAnalyzer 3.1 เพื่อนามาเปรียบเทียบกับผลการทดลอง พบว่ามีรูปแบบการเข้าจับกันบางแบบที่สามารถก่อให้เกิดแถบของผลิตภัณฑ์ที่ผิดปกติได้จริง และผล negative error เกิดมาจากการปนเปื้อนดีเอ็นเอของเชื้อ Escherichia coli O157:H7 ที่สกัด |
| abstract: E. coli O157:H7 is pathogenic bacteria that can cause severe foodborne disease and the hemolytic–uremic syndrome. It is transmitted to humans through direct contact with infected animals or consumption of undercooked ground meat products. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed for rapid and simple detection of shiga toxin-producing E. coli (STEC) in samples. A set of four primers were designed using PrimerExplorer V4 software based on shiga toxin gene. In this study, the specificity of PCR was higher than that of LAMP. LAMP products and LAMP products digested with Alu I restriction enzymes were then detected by electrophoresis on 2% and 3% agarose gels, respectively. Followed by staining with Ethidium bromide and were visualized under UV light. The result demonstrated that band sizes were not turn out as predicted and negative error occurs frequently. So abnormal LAMP product synthesis was analyzed by studying a possible binding in another region with OligoAnalyzer 3.1 software in order to compare with the result. As result , There is alternative binding pattern that can cause an error. Abnormal banding pattern and Negative error resulting from contamination of Escherichia coli O157:H7 DNA extraction. |
| . |